1927年4月，南京国民政府建立。1927年8月，国民政府正式命名同济为“国立同济大学”。当年，被命名为“国立大学”的有中央大学（后为南京大学）、中山大学（在广东）、暨南大学（在广东）、同济大学、劳动大学（1932年撤销）、艺术院（后为浙江美术学院）、音乐院（后为上海音乐学院）。这是国民政府成立后命名的第一批国立大学。当时，蔡元培任大学院院长，他对“发端于德人”的同济大学非常器重。他认为,最近数十年中国建了许多新式高校，有的采用美国式，有的采用日本式，而“美、日之高等教育均受德国影响”，“德国之教学法尤全世界所推许”。同济国立之后10年，学校经济虽时有困难，但由于国家在人力、财力方面的支持，国内外人士的关心和师生员工同心协力，从而加速发展起来。1927年8月29日，南京国民政府任命张仲苏\[京师大学(今北京大学)毕业、留德博士、曾任河北省教育厅长\]为同济大学校长，9月1日，张仲苏到校就职。当年暑期，同济大学开女禁，首招两名女生。同济国立之后，校长从此全面领导学校的校务和教务，学校虽保留董事会，但只起协助和监察作用。同时，学校根据国民政府国立大学的体制，建立了一整套组织机构，健全了规章制度，加强了对学校各个方面的管理。当时，学校经费大部分由江苏省教育经费管理处拨给，少数由国民政府大学院补助，此外则收取学生学宿费。但由于国民政府有时拨款不能兑现，江苏省政府有时停拨，张仲苏接任校长时，同济校库如洗。在这种情况下，张仲苏带领全校师生员工同舟共济，艰难办学。1929年3月，张仲苏因健康原因辞职，张群（日本陆军士官学校毕业，曾任上海兵工厂厂长、军政部政务次长兼兵工署署长）接任。3个月后，张群调任上海特别市（1927年由上海县成立上海特别市）市长。1929年6月，胡庶华（清末秀才，留德获柏林工业大学铁冶金工程师学位，江苏省教育厅长，上海炼钢厂厂长，汉阳兵工厂厂长）就任校长。他主张“大学教育应注重高深的学术，造成专门人才，并鼓励研究，以促进我国在国际学术界的地位”。胡庶华上任不久便积极扩充校舍，连年建造电气试验室、化学材料试验室、生理学研究馆和中学部教室。生理学研究馆建于1929年至1931年，其规模在国内首屈一指，分组实习可容纳100人。1930年，同济大学医、工2科均已具有相当规模。医科有教师18人，其中德籍教师12人，在校学生204人；工科有教师17人，其中德籍教师14人，在校学生77人。2科的教学、实验（实习）设备也较完善。当年，根据国民政府1929年7月26日公布的《大学组织法》关于“凡具备三学院以上者，始得称为大学”的规定，同济大学将医、工2科改称为医学院、工学院，并筹设理学院。1931年1月19日，校务会议决定，因5月18日同济大学校庆纪念日与国民党元老陈其美殉国纪念日相同，故本校校庆纪念日延长2日，改为5月20日。1931年2月，医学院学生创办《同济医学季刊》，成为医科毕业校友和在校师生进行学术交流的园地，受到医学界的赞许。同年7月，工学院创办《国立同济大学工学院报告》，内容分为机械工程、电气工程及理化三部分，分送国内外有关研究机构和图书馆交流。随着国内局势风云变幻，第一次国共合作时期成立的国民党区分部分化瓦解。在1926年下半年，由同济区分部中一些左派和要求进步的同学，共同组织的共产主义小组停止了活动，同济区分部的领导权落入右派手中。在大革命洪流中高涨起来的同济学生运动暂时转入低潮。但随着殷夫等革命斗士进入同济学习和同济学生的觉醒，革命的火种又重新燃起。1929年10月，在中共吴淞区委的领导下，同济建立了地下党支部，学生朱觉任书记，在校内外积极开展革命宣传活动。1930年3月，朱觉等党员被捕，同济地下党组织遭到严重破坏，革命活动被迫中断。1931年9月18日，日本军队悍然进攻我国东北，蒋介石采取“绝对不抵抗”方针，我东北三省很快沦陷。1931年“九·一八”事变后，胡庶华被推选为上海市抗日救国会常务委员，积极参加领导全市抗日救亡活动。一批东北流亡学生来到上海，胡庶华接收他们进入同济医学院学习。在此同时，同济学生也建立了抗日救国会，先后多次参加上海学生赴京、示威活动，强烈要求国民党停止内战，一致抗日。1932年1月28日，集结于上海的日军进攻上海，驻淞沪十九路军奋起抗战，爆发了“一·二八”事变。在“一·二八”事变中，日军飞机狂轰滥炸，吴淞地区许多工厂、学校毁于一旦。同济大学主要建筑如大礼堂、电气试验室、材料试验室、部分宿舍及实习工厂等被炸毁，图书、机器、标本、模型等设备损失更为严重。寒假过后，新学期无法上课。在此情况下，胡庶华想方设法使全校师生暂迁市区巨籁路（今巨鹿路）民生坊继续上课。同时，师生们参加抢救军民伤员，以支援十九路军与敌作战；吴淞校舍在朱家骅的帮助下，很快得以修复。1932年8月25日，学校迁回吴淞。胡庶华接任校长时，由于日本发动侵华战争等原因，政府积欠同济很多经费，学校债台高筑，积欠教师大笔薪金。胡庶华以个人信用向银行透支款项，暂维现状。胡庶华关心教师、爱护学生，受到全校上下爱戴。1932年9月，虽经同济师生一再挽留，但因学校实难维持，胡庶华辞职。几天后，教育部任命翁之龙（同济毕业，留德医学博士、北京大学教授、南京大学教授、中山大学教授兼附属医院院长）继任。1932年，政府所发经费大幅度增加，1932年是1931年的近两倍（1931年为2.8万元，1932年为5.5万元）。此后，逐年增加，1936年达7.4万元。同时，翁校长得到了教育部长朱家骅（同济早期工科学生）的支持。由此，他积极收拾“一·二八”战事破坏造成的残局，力谋全面发展。学校改变教师队伍结构，逐步做到以聘请中国教师为主，同时提高教员水平，聘用德籍教师，当时学校规定受聘德籍教师必须具有德国大学教授资格。1932年，同济大学为了解决宝隆医院实习条件的不足及医后期的上课、实习问题，积极承担市政府建造市立医院的筹备工作。1937年4月，市立医院建成，翁之龙兼任院长。根据合办医院协议的规定，市立医院所有权属市政府，使用权归同济医学院。为让学生有更多的实习机会、解决公共卫生课实地练习和研究场所，1934年，同济扩大与社会的横向联系，先后与上海市卫生局合办吴淞卫生事务所，与江苏省立医院磋商在常州、金坛、无锡、常熟设立分诊所。学校兴建、扩建和添置了教学设施。其中，扩建了解剖学研究馆和病理学研究馆，并补充了设备。药物学研究馆一度停顿，翁之龙校长从德国聘请柏林大学药物学顾信斯基博士为该馆主任，添置设备，恢复研究，并增设了国产草药研究部。同时，学校为生理学研究馆、细菌学研究馆添置了设备。以往同济图书一向分散管理。1933年11月，学校将附属机师学校宿舍改建为图书馆，1934年3月，正式建立了全校性图书馆。1935年5月20日，建成生物研究馆，馆内动物标本陈列室长约16米，玻璃片标本1000多张，挂图200余张。1937年，兴建了测量馆。学校增设了院系。1933年5月，国民党政治会议议决，将处于江湾的国立劳动大学（1932年停办）的房屋、机器、工厂等划归同济大学，创办同济大学附设高级职业学校，后奉教育部令，改称“同济大学附设高级工业职业学校”。1933年秋，成立高等测量系。鉴于电工机械系设备完善，1934年5月，增设造船及飞机机械课程，由德国造船界知名学者魏禄伯博士教课。同时，学校积极筹建造船飞机机械系，中国航空公司特捐赠飞机一架。1935年，翁之龙为筹建理学院，特聘请从英国和德国学成归国的王葆仁博士主持筹备理学院化学系。王葆仁向国外订购大量图书、仪器，奠定了化学系的基础。1935年生物研究馆开始研究动物，继而扩大到植物，之后成立生物系。1936年8月，电工机械系内增设造船组。学校扩充了学生人数。同济大学以德语为第一外语，每年可供招收的学生受到限制，因而，学校规模发展不快。为此，学校将2年制的德文补习班改为1年制，招收高中毕业生补授德文，以便有更多的学生进入同济就读。过去大学部人数较少，国家大量经费花在中学部。不仅如此，学校从1932年起，陆续与本市吴淞中学及广东中德中学，扬州高级中学、青岛礼贤中学和开封高级中学等一些有名中学签订了合作协定，要求其增设德文课程或德文班，其毕业生可入同济大学部学习。国立以前，同济学费昂贵，也是同济学生人数一直增加不快的原因之一。国立之后，经学校多次申报教育部，使学生学费终得较大减少。经以上努力，1937年全校学生从1927年的605人增加到1100人。1933年，工学院为110人，1937年猛增为291人。学校科研工作得到了发展。仅据1936年10月至1937年5月的统计，医学院组织了10次学术报告会，在1937年4月举行的第三届中国医学协会代表大会上，同济教师共作了14次学术报告。这些在解剖学、外科、眼科、病理学、药物学、生理学等方面的科研成果，全面地反映了同济医学研究的水平和成绩。在此同时，同济学生抗日爱国运动日益发展。1935年12月9日，北平学生声势浩大的抗日救亡示威游行及与军警的斗争，揭开了全国“一二·九”运动的序幕。同济学生致电声援北平学生和各界人士，积极参加上海抗日爱国运动。12月24日，同济、复旦等校学生冲破反动当局的重重阻挠，乘两列火车赴京（当时指南京）。途中，同济等校学生乘坐的火车司机溜走，同济几位学生便自行驾驶，后火车在昆山被路轨拆除阻挡。一路上，他们宣传中共中央“停止内战，一致抗日”的政治主张。1936年，同济学生李滢来、顾德熙和汪珊等先后加入中国共产党。随后，中共同济支部重新建立。随着同济声誉及地位的提高，1927年至1937年每年都有若干国家与地方政府要员来校视察，知名人士来校讲演。1933年10月《国立同济大学旬刊》创刊，蔡元培亲自题写刊名。由于学校坚持打好基础及理论联系实际的优良学风，同济学生理论基础扎实，动手能力强。对此，1936年4月1日，柏林德国工程师学会来函，承认同济大学工学院毕业生与德国工业大学毕业生具有同等资格为该会上海分会正式会员。 1937年5月20日，同济校庆30周年纪念会盛况空前，浙江省政府主席朱家骅、上海市市长俞鸿钧，教育部部长王世杰的代表黄建中司长、德国驻华大使陶德曼、上海市社会局长潘公展，各大学联合会代表以及中外来宾，暨全校师生员工共计3000余人参加典礼；蒋介石、林森、朱家骅、王世杰、俞鸿钧等分别题词，以示祝贺。会上，上海市市长俞鸿钧说：“同济毕业同学，在社会服务极众，贡献尤广，可见同济学生在校时能‘学其所用’，毕业后复能‘用其所学’。”1937年7月1日，同济大学理学院正式宣告成立，同时成立生物系、化学系，归理学院，王葆仁任理学院院长，这是第一个担任同济大学院长的中国人。至此，同济大学建成为具有医、工、理三个学院的国立大学。